Gram'ın Boyama Yöntemini Yapmanın 3 Yolu

2024 Yazar: Jason Gerald | [email protected]. Son düzenleme: 2023-12-16 11:44

Gram boyama hızlı bir tekniktir ve bir doku örneğinde bakteri varlığını görmek ve bakteriyi hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre Gram pozitif veya Gram negatif olarak sınıflandırmak için kullanılır. Gram boyama, neredeyse her zaman bakteriyel bir enfeksiyonun teşhisinde ilk adım olarak kullanılır.

Bu boyama tekniği adını, tekniği 1882'de geliştiren ve 1884'te benzer klinik semptomlara sahip iki bakteri türünü ayırt etme tekniği olarak yayınlayan Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dan (1853 - 1938) almıştır: Streptococcus pneumoniae (olarak da bilinir). Streptococcus pneumoniae), pnömokoklar) ve Klebsiella pneumoniae bakterileri.

Adım

Yöntem 1/3: Mikroskop Slaytını Hazırlama

Adım 1. Laboratuvarda çalışmaya hazırlanın

Test ettiğiniz örneğin bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için eldiven ve uzun bir saç tokası kullanın. Çalışma alanını davlumbaz altında veya iyi havalandırılan başka bir alanda temizleyin. Başlamadan önce Bunsen beki kontrol edin ve mikroskobun düzgün çalıştığından emin olun.

Adım 2. Mikroskop cam lamı sterilize edin

Cam sürgü kirliyse, yağı ve kiri çıkarmak için sabunlu suyla yıkayın. Slaytları etanol, cam temizleyici veya laboratuvarınız tarafından kullanılan başka bir yöntemle temizleyin.

Adım 3. Numuneyi cam slayt üzerine yerleştirin

Tıbbi bir numunedeki bakterileri veya bir petri kabında büyüyen bir bakteri kültürünü tanımlamaya yardımcı olması için Gram boyama tekniğini kullanabilirsiniz. En iyi sonuçlar için, örneğin ince vuruşlarında Gram boyama kullanın. Daha yaşlı bakteriler hücre duvarlarına zarar vermiş olabileceğinden ve Gram boyamaya yanıt vermeyebileceğinden, 24 saatten daha eski numunelerin kullanılması tavsiye edilir.

Bir doku örneği kullanıyorsanız, bir cam slayta 1-2 damla ekleyin. Diğer steril cam lamın kenarını kullanarak kaydırarak ince bir örnek serpme tabakası oluşturmak için lam üzerine eşit şekilde yayın. Bir sonraki adımı yapmadan önce kurumasını bekleyin.
Bir petri kabından bakteri alıyorsanız, aşılama döngüsünü parlayana kadar Bunsen beki içinde sterilize edin, ardından soğumaya bırakın. Slayt üzerine steril su damlatmak için halkayı kullanın, ardından küçük bir bakteri örneği toplamak için kullanmadan önce sterilize edin ve tekrar soğutun. Bundan sonra hafifçe karıştırın.
Et suyunda hazırlanan bakteriler tekrar vorteksleyici ile karıştırılmalı ve su ilave edilmeden yukarıdaki gibi aşılama döngüsü ile alınmalıdır.
Bir swab örneğiniz varsa (genellikle küçük bir pamuk uçlu tutamakla yapılır), swabı dokunarak slayt üzerinde hafifçe döndürün.

Adım 4. Biraz yüksek bir sıcaklık iyi bir bulaşma sağlayabilir

Isı bakterileri lamın üzerinde tutacaktır, böylece boyama işlemi sırasında kolayca çözülmezler. Bir Bunsen beki üzerinde sürgüye iki ila üç kez hızlıca vurun veya sürgüyü bir elektrikli slayt ısıtıcısı üzerinde ısıtın. Aşırı ısıtmayın, numune zarar görebilir. Bir Bunsen beki kullanıyorsanız, büyük bir turuncu alev yerine küçük ama mavi bir alev olmalıdır.

Alternatif olarak, kuru bir yaymaya 1-2 damla metanol eklenerek, kalan metanol lam üzerinde açık havada bırakılarak kurutularak metanol ile de yayma yapılabilir. Bu teknik, hücre hasarını en aza indirir ve temiz bir slayt görüntüsü arka planı sağlar

Adım 5. Sürgüyü boyama tepsisinin üzerine yerleştirin

Boyama tepsileri, üstte yumuşak bir ağ bulunan metal, cam veya sığ plastik plakalardan yapılmıştır. Sürgüleri bu ağların üzerine yerleştirin ki kullandığınız sıvı tepsiye boşaltılabilsin.

Bir boyama tepsiniz yoksa, buz küplerini yazdırmak için plastik bir tepsi üzerine bir slayt yerleştirebilirsiniz

Yöntem 2/3: Gram Boyama İşlemi

Adım 1. Kristal mor sıvıyı lekenin üzerine dökün

Gentian violet olarak da bilinen birkaç damla kristal viyole boya ile bir bakteri örneğini püskürtmek için bir pipet kullanın. 30-60 saniye bırakın. Kristal menekşe (KV), sulu çözeltide KV+ ve klorür (Cl-) iyonlarına ayrılır. Bu iyonlar hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilerin hücre duvarlarına ve hücre zarlarına nüfuz eder. KV+ iyonu bakteri hücrelerinin negatif yüklü bileşenleri ile etkileşerek hücrelere mor bir renk verir.

Birçok laboratuvar, çökelmeyi önlemek için amonyum oksalat içeren "Hucker" kristal menekşe kullanır

Adım 2. Kristal menekşeyi nazikçe durulayın

Slaytı eğin ve lam üzerine küçük bir damıtılmış veya musluk suyu akışı püskürtmek için bir yıkayıcı şişe kullanın. Smear yüzeyinden su akmalı ve doğrudan smear üzerine püskürtülmemelidir. Aşırı durulamayın. Gram pozitif bakterilerde lekelenmeyi giderebilir.

Adım 3. Yaymayı iyotla yıkayın, ardından durulayın

Yaymayı iyotla temizlemek için bir damlalık kullanın. En az 60 saniye bekletin, ardından yukarıdakiyle aynı şekilde dikkatlice durulayın. Negatif yüklü iyon formundaki iyot, KV+ ile etkileşime girerek Kristal menekşe ve iyot arasında büyük bir bileşik kompleksi oluşturur (CV-I bileşik kompleksi)) hücrenin iç ve dış katmanlarında. Bu bileşik kompleksi, lekeli yerlerde hücre içinde kristal menekşenin menekşe rengini koruyacaktır.

İyot aşındırıcı bir maddedir. Teneffüs etmekten, yutmaktan veya cilt ile temasından kaçının

Adım 4. Renk ağartıcı ekleyin, ardından hızla durulayın

Dikkatle zamanlanması gereken bu önemli adım için genellikle 1:1 aseton ve etanol karışımı kullanılır. Slaytı belirli bir açıyla konumlandırın, ardından durulama için kullanılan suda mor görünene kadar renk ağartıcı ekleyin. Bu genellikle 10 saniyeden daha kısa sürer veya ağartıcı yüksek konsantrasyonda aseton içeriyorsa daha da kısa sürer. Bu adımı hemen durdurun, aksi takdirde boya ayrıca gram pozitif ve negatif hücrelerden kristal menekşe süzecektir ve boyama işlemi tekrarlanmalıdır. Önceki tekniği kullanarak herhangi bir fazla renkli ağartıcıyı hemen durulayın.

Saf aseton (%95+) yerine kullanılabilir. Ne kadar çok aseton kullanırsanız ağartıcı o kadar hızlı çalışır, bu nedenle zamanlamaya daha fazla dikkat etmeniz gerekir.
Bu adımın süresini takip etmekte sorun yaşıyorsanız, damla damla renkli ağartıcı ekleyin.

Adım 5. Karşı boyayı lekenin üzerine serpin, ardından durulayın

Bir karşı boya, genellikle safranin veya fuksin, rengi giderilmiş (renk giderilmiş) bakterileri, yani gram negatif bakterileri pembe veya kırmızı boyayarak, gram negatif ve gram pozitif bakteriler arasındaki kontrastı artırmak için kullanılır. En az 45 saniye bekletin, sonra durulayın.

Fuchsin, Haemophilus spp ve Legionella spp gibi birçok gram negatif bakteriyi yoğun şekilde boyayacaktır. Bu yöntem yeni başlayanlar için iyidir

Adım 6. Slaytı kurutun

Kurutmak için açık havada veya bu amaçla satılan bibulous kağıt kullanarak kurutabilirsiniz. Gram boyama işlemi tamamlanmıştır.

Yöntem 3/3: Boyama Sonuçlarını Kontrol Etme

Adım 1. Işık mikroskobunu hazırlayın

Slaytı mikroskobun altına yerleştirin. Bakterilerin boyutu büyük ölçüde değişir, bu nedenle gereken toplam büyütme 400x ile 1000x arasında değişecektir. Daha keskin bir görüntü için daldırma yağına sahip bir objektif lens önerilir. Daldırma yağını lam üzerine bırakın, damlarken kabarcık oluşumunu önlemek için hareketten kaçının. Mikroskop merceği kolunu, objektif merceği yerine oturacak ve yağa değecek şekilde hareket ettirin.

Yağa daldırma, "kuru" lenslerde değil, yalnızca özel olarak tasarlanmış lenslerde kullanılabilir

Adım 2. Gram pozitif ve gram negatif bakterileri tanımlamaya çalışın

Slaytı ışık mikroskobu altında inceleyin. Gram pozitif bakterilerin rengi mor görünür, çünkü kristal menekşe kalın hücre duvarı içinde tutulur. Gram negatif bakterilerin rengi pembe veya kırmızı olacaktır, çünkü kristal menekşe pembe karşı boyanın girdiği ince hücre duvarlarından yıkanır.

Numune çok kalınsa, sonuç yanlış pozitif olabilir. Sonucun doğru olduğundan emin olmak için tüm gram pozitif bakterileri gösteriyorsa yeni bir örneği lekeleyin.
Çok fazla renk ağartıcı kullanırsanız, sonuç yanlış negatif olabilir. Sonucun doğru olduğundan emin olmak için tüm gram negatif bakterileri gösteriyorsa yeni bir örneği lekeleyin.

Adım 3. Gördüğünüz sonuçları referans görüntü ile karşılaştırın

Bakterilerin neye benzediğini bilmiyorsanız, genellikle şekle ve Gram boyamaya göre sıralanan referans görüntülerin koleksiyonunu inceleyin. [Ulusal Mikrobiyal Patojen Veritabanı, Fotoğraflarda Bakteriler ve diğer birçok çevrimiçi sitede çevrimiçi veritabanlarını da görüntüleyebilirsiniz. Tanımlamayı kolaylaştırmak için aşağıda, Gram durumlarına ve şekillerine göre sınıflandırılmış, yaygın olarak karşılaşılan veya tanı için önemli olan bakteri örnekleri verilmiştir.

Adım 4. Gram pozitif bakterileri şekillerine göre tanımlayın

Bakteriler ayrıca mikroskop altında şekillerine göre, en yaygın olarak kok (küresel) veya çubuklar (silindirik) olarak sınıflandırılır. İşte şekillerine göre gram pozitif bakterilere (mor renkli) bazı örnekler:

Gram pozitif koklar genellikle stafilokoklar (grup koklar anlamına gelir) veya streptokoklar (zincir koklar anlamına gelir).
Bacillus, Clostridium, Corynebacterium ve Listeria gibi Gram pozitif çubuklar. Çubuk bakteri Actinomyces spp. genellikle dalları veya filamentleri vardır.

Adım 5. Gram negatif bakterileri tanımlayın

Gram negatif bakteriler (pembe renkli) genellikle üç gruba ayrılır. Koklar küre şeklindedir, çubuklar uzun ve incedir, kokoid çubuklar ise aradadır.

Gram negatif koklar En yaygın olanı Neisseria spp.
Gram negatif çubuklar örneğin E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas ve diğerleri. Vibrio cholerae, normal bir gövde veya bükülmüş bir gövde olarak görülebilir.
Gram negatif "kokoid" (veya "kokobasil") çubuk bakterileri örneğin Bordetella, Brucella, Haemophilus ve Pasteurella

Adım 6. Sonuçların karışıp karışmadığını dikkatlice kontrol edin

Bazı bakterilerin hücre duvarlarının kırılganlığı veya mumsu yapısı nedeniyle tam olarak renklendirilmesi zordur. Bu bakteriler aynı hücrede veya aynı yaymada farklı hücreler arasında mor veya pembe karışımı gösterebilir. 24 saatten eski bakteri örnekleri bu sorunu gösterebilir, ancak herhangi bir örnekleme çağında renklendirilmesi zor olan bazı bakteri türleri de vardır. Bu bakteriler, asit hızlı boyama, bakteri kültüründe gözlem, TSI kültür ortamı veya genetik testler gibi tanımlama için daha özel testler gerektirir.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium ve Propionibacterium spp. hepsi gram-pozitif bakterilerdir, ancak genellikle açıkça boyanmazlar.
Treponema, Chlamydia ve Rickettsia spp gibi küçük, ince bakteriler. Gram yöntemiyle boyamak zordur.

Adım 7. Kalan tüm sarf malzemelerini ve ekipmanı atın

Bu atık bertaraf prosedürü laboratuvarlar arasında farklılık gösterir ve kullanılan malzemelere bağlıdır. Tipik olarak, boyama tepsisindeki sıvı, tehlikeli atık olarak etiketlenen şişelere atılır. Slaytları %10 çamaşır suyu çözeltisine batırın, ardından keskin bir kaba atın.

İpuçları

Gram boyama sonuçlarının ancak numune iyiyse iyi olacağını unutmayın. Hastaları iyi bir örnek sağlayabilmeleri için bilgilendirmek önemlidir (örneğin, balgam örneği almak için tükürme ile derin öksürük arasındaki fark).
Renk ağartıcı olarak etanol, asetondan daha yavaş reaksiyona girer.
Güvenliği sağlamak için standart laboratuvar düzenlemelerine uyun.
Hem gram-pozitif hem de gram-negatif bakteriler içerdiğinden, alıştırma yapmak için bir yanak çubuğu kullanın. Yalnızca bir tür bakteri görüyorsanız, çok az veya çok fazla çamaşır suyu kullanıyor olabilirsiniz.
Sürgüyü sabitlemek için tahta tokalar kullanabilirsiniz.

Uyarı

Aseton ve etanol yanıcı maddelerdir. Aseton, yağı ellerinizden çıkararak cildinizin diğer kimyasalları emmesini kolaylaştırır. Eldiven giyin ve dikkatli kullanın.
Gram lekesini veya karşı lekeyi durulamadan önce lekenin kurumasına izin vermeyin.